跑这个蛋白WB，最常踩的坑就是看到85 kDa和55 kDa双条带，顺手就把55 kDa当杂带切了。其实55 kDa根本不是杂带，它是可变剪切产生的异构体磷酸化形式，误判直接导致真实信号丢失。
💡因为带磷酸化基团，裂解液必须含1% NP-40或Triton X-100才能充分溶解膜蛋白，提取时一定加足量磷酸酶抑制剂防降解。
转膜推荐湿转法，0.2 μm PVDF膜于4°C、100V转膜1.5-2小时，转膜液里要加0.01%-0.05% SDS。一抗用Abmart同款T40116抗体1:1000稀释，二抗1:5000稀释，可根据实际信号强度按需调整。
⚠封闭千万别用脱脂奶粉！里面含的磷酸化酪蛋白会竞争性结合磷酸化抗体，直接导致高背景或者目标信号被掩盖。建议用λ-磷酸酶处理验证，处理后双条带均消失或减弱即可证实为真实信号。跑胶时注意别干片就行。
