【产品基本信息】
◆ 产品名称：CY5.5-NHS（CY5.5-活性酯，非磺化脂溶性Cy5.5 NHS酯）
◆ CAS号：1469277-96-0
◆ 结构组成：非磺化Cy5.5花菁骨架 + 连接臂 + NHS活性酯基团，染料分子量以产品规格书为准
◆ 外观性状：深蓝色至蓝紫色固体或冻干粉
◆ 溶解性：易溶于DMSO、DMF等无水有机溶剂，水溶性较弱，标记反应需少量有机溶剂助溶
◆ 光谱参数：激发峰约673 nm，发射峰约707 nm，近红外荧光
◆ 关键参数：NHS酯在弱碱性条件下与蛋白赖氨酸ε-氨基反应形成稳定酰胺键；非磺化结构属脂溶性，与水溶性Sulfo Cy5.5-NHS互为对照
◆ 储存条件：-20℃避光干燥保存，充惰性气体密封防潮，NHS酯避免接触水分，水溶液现配现用
CY5.5-NHS
【产品基本介绍】
CY5.5-NHS是一种近红外花菁活性酯，发射约707 nm，处于生物组织透明窗口，组织穿透深、背景自荧光低，适合抗体、蛋白和纳米粒的近红外标记与活体成像。NHS活性酯是较常用的蛋白标记抓手：在弱碱性条件下主动进攻蛋白表面赖氨酸残基的氨基，形成稳定酰胺键，把染料共价固定到蛋白上。该产品为非磺化版本，染料骨架不带磺酸基团，因此疏水性较强、水溶性弱于磺化Cy5.5-NHS；它适合标记抗体、疏水性蛋白以及在有机助溶条件下完成偶联，而水溶性磺化版本更适合水相直接反应、低聚集的蛋白体系。二者光谱接近但溶解性能和非特异吸附行为不同，实验选择时应根据蛋白性质和检测场景区分。使用本试剂可制备近红外荧光抗体、蛋白探针和标记型纳米载体，用于免疫荧光、流式细胞术和小动物活体成像。
【脂溶性Cy5.5活性酯蛋白标记指南】
一、标记原理与反应条件
NHS酯与蛋白氨基的反应属于亲核酰基取代：蛋白赖氨酸ε-氨基在pH 8.0～9.0条件下去质子化，具有亲核性，进攻NHS羰基形成酰胺键，释放NHS小分子。反应缓冲液应使用不含游离氨基的体系（避免Tris、甘氨酸、铵盐），常用碳酸盐缓冲液（pH 8.3～8.5）或硼酸盐缓冲液；反应pH偏低时氨基质子化、反应慢，pH过高则NHS酯自身水解加快。由于本染料为脂溶性，需先用无水DMSO或DMF将染料配成10 mg/mL左右母液，再按比例加入蛋白溶液，有机溶剂终浓度一般不超过5%，避免蛋白变性沉淀。抗体类蛋白标记时投料比是决定标记质量的核心参数，染料/蛋白摩尔比通常5～10:1，需在预实验中优化。
二、蛋白标记操作步骤
典型标记流程：将待标记蛋白（如抗体，浓度2～10 mg/mL）对标记缓冲液透析换液，去除储存液中的氨基类添加剂；称量CY5.5-NHS染料，用无水DMSO新鲜配成母液；按目标染料/蛋白摩尔比取染料母液加入蛋白溶液，边加边温和混匀；室温避光反应1 h，或4℃避光反应2～4 h；反应结束后加入少量1 M Tris-HCl（pH 8.0）或甘氨酸溶液淬灭10～15 min，封闭未反应NHS酯。脂溶性染料投料后若蛋白溶液出现浑浊或絮状物，说明有机比例过高或染料引起疏水聚集，应降低染料投料比或提高缓冲液pH与蛋白浓度。反应完成后立即进入纯化步骤，避免游离染料长期与蛋白共存造成非特异吸附。
三、纯化、取代度测定与注意事项
纯化是获得可用探针的关键步骤：常用脱盐柱（Sephadex G-25）、分子筛SEC或超滤离心管（截留分子量按蛋白选择）除去游离染料；脂溶性染料在水相中易被管壁和树脂吸附，洗脱时保持一定蛋白浓度、适当加入少量吐温或BSA可减少损失。取代度（DOL）测定：分别在280 nm（蛋白吸收）和673 nm（Cy5.5吸收）测吸光度，扣除染料在280 nm的校正系数后计算染料/蛋白摩尔比；抗体类一般标记2～5个染料/分子为宜，取代度过高会引起自淬灭、蛋白聚集和非特异吸附。注意事项：NHS酯极易吸潮水解，染料干粉取用时先回温至室温再开盖，母液现配现用；全程避光，Cy5.5对光和氧化敏感；标记产物分装单次用量，4℃短期保存或冻干-20℃长期保存。与水溶性Sulfo Cy5.5-NHS相比，本脂溶性版本标记后在疏水膜、细胞和组织上的非特异吸附偏高，免疫荧光实验中应充分封闭并设置未标记蛋白对照，评估背景水平。
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