凝胶孔隙如同筛网，不同大小的蛋白需要不同孔径
做Western Blot的人大概都有过这样的经历：条带模糊、分不开、小分子蛋白没信号，第一反应是"抗体不行"，然后开始换抗体、调整封闭时间、优化曝光条件。折腾了一圈，结果发现问题出在更前面——电泳时用的分离胶，根本不适合你的目标蛋白。
凝胶不是背景板，而是一张分子筛
很多人把凝胶当作电泳的"载体"，觉得只要胶凝好了就行。但实际上，聚丙烯酰胺凝胶是一张有孔隙的筛网，蛋白能不能被分开，全看这张网的孔径合不合适。
简单来说，胶浓度决定孔径大小：
• 高浓度胶（如12%–15%）：孔径小，适合小分子蛋白，但大蛋白迁移很慢，可能挤在胶的上方不动。
• 低浓度胶（如6%–8%）：孔径大，大蛋白容易通过，但小蛋白阻力太小，可能直接跑出胶外。
这就像用细网眼的渔网去捞大鱼——鱼确实不会漏，但挤在一起动不了；用粗网眼的网去捞小鱼——鱼全跑了。
三种常见"胶选错了"的症状
症状一：条带叠在一起，分不清谁是谁
如果你看到几条蛋白带糊成一团，分子量接近的蛋白完全分不开，先想想是不是胶太"稀"了。浓度偏低意味着孔径偏大，不同大小的蛋白迁移速度差不够大，自然叠在一起。提高2%的胶浓度，往往立刻改善。
症状二：20 kDa以下的小蛋白怎么都没信号
小分子量蛋白最"吃亏"。如果你用了常规的10%胶去跑一个15 kDa的蛋白，它很可能在你觉得"还没跑够"的时候，已经穿出了分离胶进入缓冲液。这种情况下，换多贵的抗体都没用——蛋白已经不在胶里了。改用12%–15%的胶，控制电泳时间，才是正解。
症状三：大分子蛋白停在胶顶，像被粘住了
反过来，如果你的目标蛋白是个大家伙（比如200 kDa以上），用了12%的胶，它会迁移极慢，甚至卡在浓缩胶和分离胶的交界处。这时候你看到的不是"表达量低"，而是"它压根没走下来"。降到6%–8%的胶，大分子才能正常迁移。
一个简单的自查方法
下次做WB之前，花一分钟回答两个问题：
1. 我的目标蛋白大概多少kDa？
2. 我用的胶浓度，在这个分子量范围里能给它足够的分离度吗？
常见的对应关系：80–300 kDa用6%–8%胶，20–150 kDa用10%胶，10–80 kDa用12%胶，5–40 kDa用15%胶。如果不确定，可以用预染Marker实时观察迁移位置。
结语
WB实验是一条流水线，前面任何一个环节出问题，后面都在"救火"。下次条带不好的时候，先别急着动抗体——回到制胶这一步，看看你的"筛网"选对了没有。
