在免疫学和疾病模型研究里，分选细胞的纯度和活性直接决定后续动物实验能不能做下去。纯度不够，活性不够，细胞养不活、扩增不起来，模型就立不住。
近期，信天翁生物前往广州医科大学做了一场线下实操 Demo。客户之前分选过 NK 细胞，导师看过结果后觉得不太理想。这次做小鼠 CD4+ T 细胞分选，客户直接预约了上门 Demo，希望技术人员把全流程细节盯住。
一、这次 Demo 的基本信息
二、实测结果
分选前
起始细胞总量 2.5×10⁸，细胞活性 90%，红细胞占比 25%，CD4+ T 细胞在单细胞悬液中的本底占比约 15%。红细胞占到四分之一。
分选后
纯度 97.6% ｜ 活性 95%
三个数据怎么看
纯度从 15% 到 97.6%。本底只有 15% 的情况下富集到 97.6%，意味着上清里几乎只剩目标细胞。对于后续要跑动物模型的实验来说，这一步做干净了，后面读到的表型变化才可能是真实的生物学差异，而不是杂细胞带来的噪音。
活性从 90% 升到 95%。分选后活性不降反升，原因有两层：一是阴性分选全程不结合目标细胞，CD4+ T 细胞表面没有抗体交联，不存在激活带来的损伤；二是这个样本里红细胞占了 25%，分选过程把这些非目标成分带走之后，活细胞在总量里的占比自然上去了。
沉淀干净。倾倒收集的细胞悬液离心后，沉淀里看不到红细胞，也没有磁珠残留。磁珠留在原来的流式管里跟着杂细胞一起被磁力架吸住，不会跟着上清跑过来。
三、现场把控的五个细节
客户这次特意请技术人员上门，要的就是把容易出问题的环节盯住。现场重点控了下面五处：
1. 样本处理。脾脏研磨和离心都控制得轻柔且快，避免研磨过度带来机械损伤。脾脏组织里结缔组织和脂肪要先剔干净，否则碎片会在后面造成非特异性吸附。
2. 缓冲液配方。全程使用不含钙离子、镁离子的分选缓冲液。这两类离子会干扰后续的磁珠结合，缓冲液里同样不能有游离生物素，否则会和生物素化抗体竞争链霉亲和素的结合位点。
3. 磁珠预混。Streptavidin Beads 使用前在涡旋震荡仪上充分混匀约 30 秒。磁珠静置后会沉降，不混匀直接吸取，取到的量和标注体积对不上，直接影响去除效率。混匀之后不能再高速离心。
4. 磁力架静置。严格按 2.5 min 静置，不提前倾倒。倾倒时保持连贯，流式管全程不脱离磁力架，倒完在倾斜状态停留 2 至 3 秒再扶正。管口挂着的液滴直接丢弃，不甩回去。
5. 无菌操作。整个分选过程在生物安全柜内完成，耗材全部无菌。下游要做动物实验，任何细菌或真菌污染都会让整批细胞作废。
四、标准化操作要点
下面按 FiniGet 分必得® 130-6002 说明书整理。操作全程在室温下进行，全程无菌，缓冲液不含钙离子、镁离子和游离生物素。
步：制备单细胞悬液
取 C57BL/6 小鼠脾脏，在 70 μm 细胞筛网上轻柔研磨，用分选缓冲液冲洗筛网，收集细胞悬液于 50 mL 离心管。500 g 离心 5 min，弃去上清。这一步不需要 ACK 裂红，靠物理研磨加离心就能完成样本预处理。
第二步：重悬并调整浓度
将细胞沉淀重悬于分选缓冲液中，调整浓度至 1×10⁸ cells/mL。缓冲液推荐含 1 mM EDTA 和 2% FBS 的 PBS，预先经 0.22 μm 滤膜过滤除菌，也可以直接用 FiniGet 分必得® 140-2001 细胞分选缓冲液。
第三步：抗体孵育
按每 1×10⁷ 细胞取 100 μL 细胞悬液加至无菌流式管底部，加入 5 μL Mouse FcR Blocker 轻轻混匀，再加入 10 μL Mouse CD4+ T Cell Isolation Cocktail 混匀，室温孵育 10 min。FcR Blocker 属于可选项，样本里巨噬细胞、树突状细胞较多时建议加上。
第四步：磁珠孵育
孵育完成后加入 7.5 μL Streptavidin Beads，轻轻混匀，室温孵育 2.5 min。磁珠体积按每 1×10⁷ 细胞计，细胞量变化时同比例调整。孵育过程中若出现沉淀，可每 1 至 2 min 轻弹管壁或吸打混匀。
第五步：磁力架分离
孵育完成后加入分选缓冲液将体积补至 2.5 mL，用移液器轻轻吹打几次，将流式管置于配套的 FiniGet 分必得® 140-2000 单孔磁力架 上静置 2.5 min。实验体系不要超过 2.5 mL，体积过大会超出磁极的有效分选范围。
第六步：倾倒收集
拿起磁力架，将细胞悬液轻柔、连贯地倾倒至无菌离心管中。磁极和流式管在倾倒状态下保持 2 至 3 秒后恢复正立。此时管内的悬液就是纯化后的小鼠 CD4+ T 细胞，表面不带任何抗体或磁珠标记。
细胞量放大时怎么处理
说明书的标准体系按每 1×10⁷ 细胞设计，配套 140-2000 单孔磁力架时单管处理上限为 2×10⁸ cells。起始细胞量超过这个数，需要按细胞总数等比例放大 Cocktail 和磁珠的用量，并分装到多支流式管中并行处理，补液后保证单管体系仍控制在 2.5 mL 以内。Cocktail 和磁珠的用量不能凭经验估，一定按细胞数换算。
五、几个容易踩的坑
缓冲液不能图省事。下游要求越高，越要避免用成分不明的缓冲液。含钙镁离子的 PBS 会影响磁珠结合，含游离生物素的缓冲液会抢占链霉亲和素的结合位点，两者都会让去除效率打折扣。建议用配套的无菌、无内毒素分选缓冲液。
磁珠混匀这一步不能跳。静置后的磁珠沉降在管底，直接吸取会导致实际加入量偏少。涡旋 30 秒是说明书明确要求，混匀后也不能再高速离心，否则磁珠会聚团。
倾倒手法决定纯度。倾倒要连贯，中途不能停顿、不能摇晃。流式管一旦离开磁力架，已经吸在管壁上的磁珠-杂细胞复合物就可能重新散回悬液。管口那滴液体不要甩回去，直接丢掉。
分选完尽快进入下游。细胞离开原始环境后状态会逐渐下降，分选完成后按实验需要洗涤，重悬于合适的缓冲液或培养基，尽早开始下一步。
六、常见问题
Q1：为什么之前分选 NK 细胞的效果不理想？
A：NK 细胞分选对样本状态和操作细节都比较敏感，起始细胞活性、红细胞和碎片残留、磁珠用量与细胞量是否匹配，任何一个环节出问题都会反映在纯度上。这也是客户这次直接要求技术人员上门、把 CD4+ T 细胞分选全流程走一遍的原因。
Q2：分选后的细胞活性怎么保证？
A：三个环节。一是选阴性分选，抗体和磁珠都不接触目标细胞，没有受体交联带来的激活损伤；二是缓冲液配方要对，不含钙镁离子和游离生物素；三是操作轻柔快速，研磨不过度、离心参数不超标、倾倒不粗暴。这次起始活性 90%，分选后到 95%。
Q3：分选后的细胞可以直接重悬在培养基里吗？
A：看下游需求。马上要做培养或激活实验的，直接重悬在完全培养基里就行。
Q4：脾脏样本红细胞多，不裂红会不会影响分选？
A：FiniGet 分必得® 130-6002 针对小鼠脾脏样本做过适配，样本制备阶段走 70 μm 筛网研磨加 500 g 离心弃上清的物理方法即可，不需要 ACK 裂解液。这次样本红细胞占比达到 25%，分选后沉淀里也没有红细胞残留。
结语
这场 Demo 的价值不只在那个 97.6% 的数字上。客户此前在别的分选上吃过亏，导师一句话就把整个方案否了，所以这次要的不只是试剂盒，而是有人把流程盯到底。从样本研磨的手法，到磁珠混匀的 30 秒，到倾倒时管子在磁力架上停留的那 2 至 3 秒，每一处都按说明书走，结果自然稳。
小鼠 CD4+ T 细胞分选的更多实测数据，可以看 小鼠 CD4+ T 细胞分选六组流式实测汇总；同系列的小鼠 CD8+ T 细胞分选试剂盒（130-6003）和 小鼠 NK 细胞分选试剂盒 130-6005 也有对应的流程说明。
细胞分选上门实测行动
信天翁生物细胞分选上门实测行动持续面向全国高校、医院、科研实验室开放免费预约。技术人员上门演示 FiniGet 分必得® 全系分选试剂盒的标准化流程，现场出具流式纯度数据，针对回收率偏低、缓冲液选择不清、样本背景复杂、高纯度活性要求高等高频问题提供实操优化方案。
更多 Demo 实测案例与试剂盒详情，可以看 FiniGet 分必得® 细胞分选试剂盒。
